線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ活性測試盒實驗科研
測定意義:線粒體復合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中,由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學梯度催化ATP合成,也可逆過程水解ATP。此外,復合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細菌中。復合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關鍵酶。
測定原理:復合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi,通過測定Pi增加速率來測定復合體Ⅴ活性。
需要的儀器,耗材:可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣本處理
1. 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞,加入 1.0 mL 提取液,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2. 4 ℃ 600g 離心 10min。
3. 將上清液移至另一離心管中,4 ℃ 11000g 離心 15min。
4. 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅴ(此步可選做,可以判斷線粒體提取效果)。
5. 在沉淀中加入 600μL 試劑一,超聲波破碎(功率 20%,超聲 5 秒,間隔 10 秒,重復 12 次),用于復合體Ⅴ酶 活性測定,并且用于蛋白含量測定。
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